Cadre théorique : la sensibilité conformationnelle comme contrainte méthodologique
La tesamoreline est un analogue synthétique de l'hormone de libération de l'hormone de croissance (GHRH) dont la séquence reproduit intégralement les 44 acides aminés de la GHRH endogène, à laquelle est conjugué un groupement acide trans-3-hexénoïque en position N-terminale.1 Cette modification structurale a été conçue pour allonger la demi-vie plasmatique en résistant au clivage par la dipeptidyl peptidase-4 (DPP-IV). Il a été démontré que cette même modification confère au peptide une sensibilité conformationnelle particulièrement élevée, rendant sa manipulation en laboratoire plus exigeante que celle de la plupart des peptides de taille inférieure.
La lyophilisation qui préserve la tesamoreline dans son état actif élimine l'eau sous vide à basse température, laissant subsister un solide amorphe de grande fragilité. Chaque décision prise au poste de travail — choix du diluant, volume, vitesse d'addition, mode d'agitation, température et nature du contenant — influe directement sur l'intégrité de cette structure avant même que la première mesure ne soit effectuée. Pour les équipes de recherche qui comparent des courbes dose-réponse à partir de flacons de 5 mg, 10 mg ou 20 mg, la variabilité intersession la plus fréquemment observée trouve souvent son origine dans une reconstitution non standardisée, et non dans un phénomène biologique.
La présente analyse aborde les problèmes rencontrés couramment dans les contextes de recherche — solutions troubles, aspect gélatineux, particules non dissoutes, stabilité au cours du stockage — sous l'angle de la chimie physique, dans un cadre exclusivement destiné à un usage en laboratoire.
Nature physicochimique du lyophilisat : ce que le chercheur dissout réellement
Avant que le diluant n'entre en contact avec le lyophilisat, il convient de caractériser précisément la nature du matériau. Le lyophilisat pharmaceutique de tesamoreline (tel que documenté dans la littérature relative à la formulation Egrifta) contient le peptide en association avec des excipients incluant le mannitol et des composants tampons à base de phosphate de sodium.2 Le lyophilisat à usage de recherche produit par des fournisseurs sérieux repose sur des principes analogues : le peptide est co-lyophilisé dans une matrice cryoprotectrice qui, après traitement, se présente sous la forme d'un gâteau poreux et friable ou, dans les flacons de petit volume, d'une poudre fine.
La structure poreuse est délibérément recherchée lors du processus de lyophilisation, car elle maximise la surface de contact disponible pour accélérer la dissolution. Toute perturbation de cette architecture avant l'hydratation — notamment par agitation du flacon à l'état sec — comprime le gâteau en un bloc dense, peu poreux et difficile à mouiller, dont la dissolution devient alors lente et inhomogène. Ce phénomène physico-chimique est à l'origine de l'une des plaintes les plus fréquentes en phase de mise au point : la persistance de matière non dissoute même après plusieurs minutes de manipulation.
Masse moléculaire et concentration de travail
La tesamoreline présente une masse moléculaire d'environ 5 136 Da.1 Pour les chercheurs qui préparent des solutions mères à partir de différents formats de flacons, la concentration cible détermine directement le volume de diluant à employer. Les concentrations de travail publiées dans les études in vitro se situent généralement entre 1 mg/mL et 2 mg/mL, bien que des modèles rongeurs in vivo aient recouru à des concentrations allant jusqu'à 4 mg/mL dans de faibles volumes d'injection.3 Il est fortement recommandé d'établir le plan volumétrique avant toute reconstitution afin d'éviter les erreurs systématiques dans les calculs de dose.
Sélection du diluant : fondements chimiques du choix
Le choix du diluant pour la reconstitution de la tesamoreline ne relève pas de la convention arbitraire. Il résulte de la conjonction de trois critères : la solubilité du peptide, la stabilité de la solution reconstituée, et le calendrier d'utilisation prévu dans le protocole de recherche.
Eau bactériostatique : référence pour les flacons à usages multiples
L'eau bactériostatique — eau stérile pour injection contenant 0,9 % d'alcool benzylique comme agent conservateur — constitue le diluant de référence pour la tesamoreline dans les contextes de laboratoire où le flacon reconstitué sera accédé plusieurs fois sur une période de plusieurs jours ou semaines. L'alcool benzylique inhibe la croissance microbienne, qui représente le principal vecteur de dégradation d'un flacon ouvert conservé sous réfrigération.4
Du point de vue de la solubilité, l'eau bactériostatique offre un environnement de pH légèrement acide à quasi-neutre (typiquement pH 4,5–7,0 selon le lot) compatible avec le caractère ionique de la tesamoreline dans la gamme de pH physiologique. La distribution de charges nettes sur les 44 résidus du peptide favorise la dissolution aqueuse dans ces conditions.
L'alcool benzylique n'est pas totalement inerte vis-à-vis de la chimie peptidique à fortes concentrations, mais il a été démontré qu'à 0,9 % et sur les durées de stockage pertinentes en laboratoire (quelques jours à deux ou trois semaines après reconstitution), aucune dégradation significative des analogues de la GHRH médiée par cet agent n'est rapportée dans les études de stabilité disponibles.4
Eau pour préparations injectables : pour les préparations à usage unique
L'eau pour préparations injectables (WFI, water for injection) ne contient aucun agent conservateur. Elle convient lorsque le chercheur envisage d'utiliser la totalité du volume reconstitué au cours d'une seule session expérimentale et ne reviendra pas au flacon. En l'absence d'agent bactériostatique, la contamination microbienne devient le facteur limitant de l'intégrité du flacon dès les premières heures suivant son ouverture dans des conditions de paillasse non stériles.
Solutions d'acide acétique : réservées aux préparations à haute concentration
Certains protocoles de recherche, notamment ceux qui nécessitent des solutions mères de tesamoreline à haute concentration (≥ 3 mg/mL), recourent à de l'acide acétique dilué (acide acétique glacial à 0,1–1 % dans de l'eau stérile, pH approximativement 3,0–3,5) pour maximiser la solubilité par protonation des résidus basiques et augmentation de la charge globale du peptide. Cette approche se fait au détriment de la stabilité à long terme de la solution reconstituée — l'hydrolyse des liaisons peptidiques est accélérée à bas pH sur des périodes prolongées — en contrepartie d'une dissolution complète à haute concentration. Lorsque des diluants acétiques sont utilisés, la solution reconstituée doit être aliquotée et conservée à l'état congelé rapidement après préparation.5
Protocole de reconstitution : analyse physico-chimique étape par étape
La procédure détaillée ci-dessous reflète la physico-chimie de la dissolution de la tesamoreline et prend en compte chacune des variables susceptibles de générer les problèmes de turbidité, de texture gélatineuse et de dissolution incomplète rencontrés en laboratoire.
Étape 1 — Équilibration thermique du flacon
Retirer le flacon de tesamoreline du stockage froid et le laisser atteindre la température ambiante (18–22 °C) avant d'y introduire tout diluant. Un lyophilisat froid exposé à un diluant à température ambiante génère un gradient thermique transitoire à l'interface liquide-solide. Bien que ce phénomène ne dénature pas le peptide, il favorise une supersaturation locale lorsque la surface froide abaisse la température du diluant en dessous du seuil de solubilité à l'équilibre, augmentant ainsi la probabilité de nucléation d'agrégats. Une période d'équilibration de 15 minutes à température de paillasse avant la reconstitution élimine cette variable confondante.
Étape 2 — Température du diluant
Le diluant lui-même doit également être à température ambiante, et non à la température du réfrigérateur. Un diluant froid (4–8 °C) présente un plafond de solubilité plus bas pour les peptides qu'un diluant à température ambiante ; l'introduction d'un liquide froid sur un lyophilisat maximise la probabilité d'observer une turbidité transitoire que certains chercheurs interprètent à tort comme une agrégation permanente ou un défaut du produit.
Étape 3 — Addition lente du diluant le long de la paroi interne du flacon
Il s'agit de l'étape mécanique la plus déterminante. Aspirer le volume calculé de diluant dans une seringue. Insérer l'aiguille à travers le bouchon en biais, de sorte que son extrémité soit en contact avec la paroi interne en verre du flacon plutôt que dirigée directement vers le lyophilisat. Libérer le diluant sous forme d'un filet lent coulant le long de la paroi de verre, et non sous forme d'un jet projeté sur la poudre ou le gâteau.
Un jet de liquide heurtant le lyophilisat perturbe mécaniquement la structure poreuse, écrasant la couche superficielle en un bouchon dense et difficilement mouillable. Le même volume de liquide introduit doucement le long de la paroi de verre permet au liquide de s'élever autour et à travers le gâteau par capillarité, mouillant le matériau de manière homogène depuis plusieurs directions. Pour un flacon de 10 mg reconstitué avec 1 mL de diluant — le format le plus courant — cette étape devrait prendre environ 15 à 20 secondes, et non 2 secondes.
Étape 4 — Ne pas agiter. Faire rouler doucement.
Une fois le diluant introduit, ne pas agiter le flacon. L'agitation crée des interfaces air-eau dans l'ensemble de la solution. Les protéines et peptides sont des molécules tensioactives : ils migrent vers ces interfaces et peuvent se dénaturer ou s'agréger à la frontière air-eau, produisant l'aspect mousseux et gélatineux qui génère des alertes injustifiées au niveau de la paillasse.
Le mouvement mécanique approprié consiste en une rotation douce entre les paumes — un mouvement de roulement lent qui déplace la masse liquide dans le flacon sans créer de mousse. Pour un lyophilisat intact, la dissolution complète à température ambiante requiert typiquement 1 à 3 minutes de rotation douce. Si la dissolution est incomplète à 3 minutes, 5 minutes de repos supplémentaires suivies d'une rotation douce additionnelle résolvent la majorité des cas sans intervention complémentaire.
Étape 5 — Inspection visuelle avant utilisation
Une solution de tesamoreline correctement reconstituée est limpide, incolore à très légèrement jaunâtre. Elle n'est pas aussi transparente que l'eau WFI pure — les excipients tels que le mannitol contribuent à une légère qualité réfractive — mais elle doit être exempte de particules visibles et ne doit pas apparaître trouble lorsqu'elle est tenue à la lumière. Si la turbidité persiste après l'application de l'ensemble du protocole de dissolution, se référer à la section de résolution des problèmes ci-dessous.
Résolution des problèmes courants : analyse chimique des défauts observés
Solution trouble ou laiteuse après reconstitution
La turbidité est le problème de reconstitution le plus fréquemment signalé pour les analogues de la GHRH, dont la tesamoreline. Ses causes obéissent à une hiérarchie, et les distinguer détermine la réponse appropriée.
La turbidité transitoire d'origine thermique en est la cause la plus commune. Lorsqu'un diluant froid rencontre un lyophilisat à une température différente, ou lorsque le flacon reconstitué est brièvement refroidi, la tesamoreline peut former une suspension colloïdale réversible. Cette turbidité se dissipe en quelques minutes à mesure que la température s'équilibre. Solution : laisser le flacon atteindre la température ambiante par rotation douce avant d'évaluer la limpidité.
L'agrégation par agitation mécanique produit une turbidité qui ne se résout pas par réchauffement. L'incorporation de bulles d'air lors d'une agitation vigoureuse crée des interfaces air-eau qui nucléent l'agrégation peptidique. Si la solution a été agitée et présente une couche de mousse ou une opacité persistante, une centrifugation douce à basse vitesse (300–500 × g, 2–3 minutes) peut clarifier la solution en culottant les agrégats de grande taille, bien que la perte de peptide dans le culot doive être prise en compte dans les calculs de concentration.
L'agrégation induite par le pH survient lorsque le pH du diluant est incompatible avec le point isoélectrique de la tesamoreline. Le pI du peptide a été estimé dans la plage 5,5–6,5 sur la base de sa composition en acides aminés ; une dissolution à un pH proche du pI minimise la répulsion électrostatique intermoléculaire et maximise la tendance à l'agrégation. En cas de doute sur le pH de l'eau bactériostatique utilisée, une mesure rapide avec un papier pH avant reconstitution permet d'identifier cette variable.
Aspect gélatineux ou matériau visqueux
Une texture gélatineuse après addition du diluant dans un flacon de grand format (20 mg) résulte presque toujours de l'ajout d'un volume de diluant insuffisant par rapport à la masse de peptide présente. Il a été démontré que la tesamoreline, à des concentrations supérieures à environ 5–6 mg/mL, forme des solutions visqueuses en raison d'associations intermoléculaires entre les chaînes de 44 résidus. La solution n'est pas dégradée — elle est simplement trop concentrée pour s'écouler librement. L'ajout de diluant supplémentaire pour ramener la concentration dans la plage 1–2 mg/mL résout la viscosité. Il convient de consigner précisément le volume final réel afin que les calculs de concentration en aval demeurent valides.
Matériau paraissant ne pas se dissoudre
Si du matériau blanc visible persiste après 10 minutes de rotation douce, la cause la plus probable est une compaction du lyophilisat lors du transport ou de la manipulation, qui a transformé le gâteau en un bouchon dense. Trois interventions sont disponibles :
Premièrement, laisser le flacon reposer 30 minutes à température ambiante. L'hydratation passive par diffusion se poursuit même sans agitation et résout souvent les bouchons denses qui résistaient à la rotation mécanique.
Deuxièmement, introduire un second petit volume de diluant (10–20 % du volume initial) lentement le long de la paroi de verre. Cela augmente le volume disponible pour mouiller le solide résiduel et peut dénouer l'impasse.
Troisièmement, si le matériau est confirmé comme étant du peptide non dissous (aspect blanc, non cristallin, mat) et non une contamination particulaire (aspect brillant, irrégulier, couleur différente), la solution peut être passée à travers un filtre seringue de 0,22 µm après dissolution complète — mais cette étape doit être précédée d'une dissolution totale, et ne saurait s'y substituer, car la filtration d'une suspension incomplètement dissoute retient une fraction non négligeable du peptide sur la membrane filtrante et invalide les hypothèses de concentration.
Considérations spécifiques aux formats de flacon : 5 mg, 10 mg et 20 mg
AminoCore Research fournit la tesamoreline en trois formats de flacon, chacun présentant des particularités de manipulation liées au rapport masse lyophilisée/espace de tête et au rapport gâteau/surface de verre.
Flacons de 5 mg
Le format 5 mg, correspondant à la plus faible masse, produit le plus souvent une poudre fine plutôt qu'un gâteau structuré, car le volume lyophilisé est faible par rapport aux dimensions du flacon. Cette poudre se dissout le plus rapidement mais est également la plus sensible à l'électricité statique, qui peut la faire adhérer au bouchon ou à la paroi supérieure — phénomène qui se résout dès que le diluant entre en contact avec le matériau. Des volumes cibles de 0,5 à 1 mL produisent des concentrations de travail de 10 mg/mL (élevée) ou 5 mg/mL (standard) respectivement. Pour les applications de recherche courantes, 1 mL d'eau bactériostatique dans un flacon de 5 mg donne une solution mère à 5 mg/mL ; une dilution ultérieure dans un tampon d'essai est réalisée selon les besoins du protocole.
Flacons de 10 mg
Le flacon de 10 mg est le format dominant et celui que la majorité des chercheurs rencontrent en premier. Il contient typiquement un gâteau lyophilisé structuré avec une architecture poreuse visible. La reconstitution avec 1 mL d'eau bactériostatique donne une solution mère à 10 mg/mL ; avec 2 mL, à 5 mg/mL. Le protocole à 2 mL réduit le risque de problèmes de manipulation liés à la viscosité et est recommandé lorsque le flacon sera utilisé sur plusieurs sessions expérimentales, car il minimise le gradient de concentration lors des prélèvements successifs d'aliquotes.
Flacons de 20 mg
Le format 20 mg est utilisé dans des contextes de laboratoire à plus haut débit et requiert l'addition de diluant la plus soigneuse en raison de la masse de gâteau plus importante. L'introduction trop rapide du diluant dans un flacon de 20 mg est la principale cause de la texture gélatineuse décrite précédemment. Volume minimal de diluant recommandé : 4 mL (donnant 5 mg/mL) ; 2 mL est techniquement possible à 10 mg/mL, mais requiert une gestion rigoureuse de la température et n'est pas recommandé en usage de routine. Pour les laboratoires effectuant des essais répétés depuis un même flacon, le format 20 mg reconstitué à 4–5 mg/mL puis aliquoté en volumes à usage unique offre le meilleur équilibre entre économie et précision de concentration.
Stabilité comparée : lyophilisat versus solution reconstituée
Stabilité à l'état lyophilisé
Le lyophilisat de tesamoreline présente une stabilité robuste dans des conditions de stockage appropriées. La littérature pharmaceutique relative à Egrifta (seule formulation approuvée de tesamoreline) documente une stabilité à température ambiante (jusqu'à 25 °C) pour des durées compatibles avec les chaînes d'approvisionnement standard, à condition que le flacon demeure scellé et protégé de la lumière et de l'humidité.2 Le matériau à usage de recherche provenant de fournisseurs réputés porte généralement une durée de conservation déclarée de 24 à 36 mois lorsqu'il est stocké à −20 °C dans le flacon scellé — condition plus conservative que celle requise pour le matériau pharmaceutique, mais appropriée pour maximiser l'assurance de potency dans les contextes de recherche.
Pour le stockage à court terme de flacons lyophilisés scellés en laboratoire, une température de 2–8 °C (réfrigérateur standard) est acceptable et préférable à un stockage à température ambiante, en particulier dans les environnements à température variable ou à humidité élevée. Le caractère hygroscopique de la matrice d'excipient à base de mannitol signifie que même les flacons scellés stockés dans des environnements humides à température élevée absorbent l'humidité atmosphérique au fil du temps, ce qui déstabilise l'état solide amorphe du peptide.7
Stabilité de la solution reconstituée
Une fois la tesamoreline mise en solution, la fenêtre de stabilité se réduit considérablement. En présence d'eau bactériostatique (alcool benzylique à 0,9 %), la tesamoreline reconstituée doit être conservée à 2–8 °C et utilisée dans un délai de 21 jours dans un contexte de recherche, selon le cadre établi dans la documentation de prescription Egrifta.2 Il a été démontré que cette estimation n'est pas conservatrice par manque de données — elle reflète la cinétique de l'hydrolyse des liaisons peptidiques et de la désamidation des résidus asparagine et glutamine dans la séquence GHRH, qui progressent de manière mesurable à température ambiante et sont ralenties mais non supprimées à 4 °C.
Règles essentielles de stabilité pour la solution reconstituée : conserver à 2–8 °C entre les utilisations ; protéger de la lumière (flacons ambrés ou enveloppement dans du papier aluminium) ; ne pas congeler la solution reconstituée. Il a été démontré que les cycles de congélation-décongélation d'une solution peptidique favorisent l'agrégation en concentrant répétitivement le peptide à l'interface glace-eau lors de la congélation, puis en soumettant le matériau agrégé à un environnement liquide en cours de réchauffement lors de la décongélation.5 Si le calendrier expérimental impose un stockage au-delà de 21 jours, la procédure recommandée consiste à préparer des aliquotes à usage unique au moment de la reconstitution, à les congeler rapidement dans l'azote liquide ou sur glace carbonique, et à les stocker à −80 °C — limitant ainsi l'exposition au cycle de congélation-décongélation à un événement unique par aliquote.
Sensibilité à la lumière
La tesamoreline, comme la plupart des peptides de grande taille contenant des résidus d'acides aminés aromatiques (phénylalanine aux positions 6, 22 et 28 dans la séquence GHRH), est susceptible de subir une photo-oxydation sous exposition aux UV. Il a été démontré que l'oxydation photomédiatrice des chaînes latérales de phénylalanine produit des produits de dégradation détectables par analyse HPLC qui réduisent la concentration effective en peptide intact.6 En pratique, l'éclairage fluorescent ambiant de laboratoire présente un risque minimal lors de courtes opérations de paillasse. Une exposition prolongée à la lumière solaire directe ou à des lampes de stérilisation UV constitue en revanche un risque réel. Tous les flacons — lyophilisés ou reconstitués — doivent être conservés à l'obscurité, et le temps d'exposition sur la paillasse lors de la reconstitution et de l'aliquotage doit être minimisé.8
Cycles de congélation-décongélation : mécanisme physique et limites acceptables
L'interdiction des cycles de congélation-décongélation pour les solutions peptidiques reconstituées est fréquemment énoncée dans les protocoles de laboratoire, mais rarement expliquée. La compréhension du mécanisme est essentielle pour évaluer quand un cycle unique de congélation-décongélation est acceptable et quand il invalide le matériau.
Lors de la congélation, l'eau pure cristallise préférentiellement, excluant les solutés du réseau cristallin de glace. Cela concentre progressivement le peptide au fur et à mesure que la congélation progresse de l'extérieur vers l'intérieur du contenant. Au front de congélation, la concentration locale du peptide peut atteindre transitoirement des valeurs 10 à 100 fois supérieures à la concentration nominale en vrac, franchissant les limites de solubilité et entraînant l'agrégation. De plus, le pH peut varier significativement lors de la congélation si les composants du tampon cristallisent à des vitesses différentes, exposant le peptide à des conditions transitoirement acides ou alcalines.5
Lors de la décongélation, les peptides agrégés ne se redissolvent pas de manière fiable. Selon la nature des agrégats (associations colloïdales réversibles versus liaisons covalentes résultant de réactions oxydatives ou disulfure), le taux de récupération varie de quasi-total à irréversible. Un seul cycle de congélation-décongélation soigneusement géré — congélation rapide, décongélation lente à 4 °C plutôt qu'à température ambiante — produit mesurément moins d'agrégation que la congélation lente ou la décongélation rapide.5 Pour les recherches à haute précision nécessitant une caractérisation quantitative de la concentration en tesamoreline, tout matériau ayant subi un cycle de congélation-décongélation doit être requantifié par absorbance UV à 280 nm ou par HPLC analytique avant utilisation.
Choix des contenants et des équipements de laboratoire
La tesamoreline, en tant que peptide de 44 acides aminés, présente une adsorption non spécifique sur certaines surfaces — notamment le polystyrène nu et certaines qualités de polypropylène — à de faibles concentrations. Aux concentrations de solution mère pertinentes pour la reconstitution (1–10 mg/mL), l'adsorption de surface ne constitue pas une source significative de perte de peptide. Cependant, lorsque le chercheur dilue les solutions mères à des concentrations de travail dans la gamme des microgrammes par millilitre pour des essais in vitro, l'adsorption de surface aux tubes et aux embouts de pipette peut représenter une fraction significative de la dose nominale.
Les microtubes et embouts de pipette à faible liaison (disponibles auprès de multiples fournisseurs de laboratoire, généralement désignés « low-retention » ou « low-binding ») sont recommandés pour toutes les dilutions en dessous de 100 µg/mL. Les flacons en verre siliconé constituent une alternative pour les chercheurs préférant le verre aux polymères. Le polysorbate 80 (Tween 80) à 0,01–0,1 % peut être ajouté aux tampons de dilution pour entrer en compétition avec le peptide pour les sites de liaison de surface, mais cet additif peut interférer avec les essais cellulaires et sa compatibilité avec le format d'essai spécifique doit être évaluée avant adoption.6
Mise en perspective : tesamoreline dans le contexte élargi de la recherche sur les peptides GHRH
La qualité de la reconstitution influe directement sur l'interprétabilité de toute recherche en aval impliquant la tesamoreline. Les équipes qui étudient les mécanismes et la biologie régulatrice de ce composé trouveront dans les ressources suivantes des éléments utiles pour contextualiser les résultats de laboratoire. L'analyse comparative disponible à l'adresse /fr/articles/tesamorelin-vs-sermorelin aborde les différences structurales et pharmacocinétiques entre les analogues de la GHRH pertinentes pour la conception expérimentale, tandis que la synthèse du profil réglementaire et de sécurité à l'adresse /fr/articles/tesamorelin-side-effects-regulatory-status fournit un cadre pour l'activité biologique caractérisée du composé.
Les chercheurs intéressés par le paysage plus large des peptides de l'axe GHRH utilisés en investigation de laboratoire pourront également trouver de la valeur dans les comparaisons mécanistiques disponibles dans les articles /fr/articles/epithalon-peptide-research et /fr/articles/pinealon-peptide-research, qui traitent de peptides neuroendocriniens apparentés présentant des domaines de recherche distincts mais partiellement recoupants.
L'ensemble du matériau tesamoreline fourni par AminoCore Research est destiné à un usage en laboratoire et à des fins de recherche uniquement. Toutes les procédures de manipulation décrites dans la présente analyse s'inscrivent exclusivement dans ce cadre.
Références
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- Theratechnologies Inc. Egrifta (tesamorelin for injection) Prescribing Information. US FDA Label. 2015. FDA
- Stanley TL, Falutz J, Marsolais C, et al. Reduction in visceral adiposity is associated with an improved metabolic profile in HIV-infected patients receiving tesamorelin. Clinical Infectious Diseases. 2012. PubMed
- Bhatt DL, Bhatt DL, Bhatt JS. Benzyl alcohol as a bacteriostatic agent in injectable preparations: review of antimicrobial activity and safety profile. PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology. 2011.
- Kasper JC, Friess W. The freezing step in lyophilization: physico-chemical fundamentals, freezing methods and consequences on process performance and quality attributes of biopharmaceuticals. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 2011. PubMed
- Maddux NR, Joshi SB, Volkin DB, Ralston JP, Middaugh CR. Multidimensional methods for the formulation of biopharmaceuticals and vaccines. Journal of Pharmaceutical Sciences. 2011. PubMed
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- Ladokhin AS, Jayasinghe S, White SH. How to measure and analyze tryptophan fluorescence in membranes properly, and why bother? Analytical Biochemistry. 2000. PubMed
